成年人每天有超过 500 亿个细胞发生凋亡，以维持免疫稳态。What？500 亿？淡定，成年人体内约有 28 万亿个 (女性) - 36 万亿个 (男性) 个细胞。这就相当于你一天赚 1w，成本 500 哈哈哈。不过话说回来，这 500 亿的细胞凋亡之后，就“全剧终”了么？

细胞凋亡 (Apoptosis)，又称程序性细胞死亡，一种为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。往期小 M 已为大家介绍过细胞凋亡及其检测。

细胞凋亡过程中，可释放一类特殊的细胞外囊泡，称之为凋亡囊泡 (Apoptotic vesicles, apoVs)，其具有良好的免疫调节和促再生作用，而凋亡缺陷会导致严重的自身免疫性疾病 (如系统性红斑狼疮)、衰老和肿瘤等。



 Tips: ApoV 从其亲代细胞继承了多种成分，包括 DNA、RNA、蛋白质和脂质，这些成分可以调节受体器官和组织。

研究表明，细胞凋亡缺陷和 H₂S 缺陷均可导致严重的免疫紊乱，那么细胞凋亡过程是否与内源性 H₂S 的产生有关呢？哎嘿，好巧不巧 ，凋亡产气！

近期，施松涛/陈畅团队在 Cell 子刊 Cell Metabolism 上发表了题为：Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation 的研究论文[1]。

图 1. 细胞凋亡释放 H₂S 气体抑制 Th17 细胞分化^[1]。

该研究探讨了凋亡、 (H₂S)、以及系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus,SLE) 之间的联系，发现细胞凋亡是机体 H₂S 的重要来源，且凋亡细胞产生的凋亡囊泡 (apoV) 可继承 H₂S 生成能力，揭示了细胞凋亡在维持 H₂S 稳态中的相关机制，让我们一起来瞅瞅到底是个啥子情况？

目前，凋亡缺陷的 MRL/lpr (B6.MRL-Faslpr/J) and Bim−/− (B6.129S1-Bcl2l11tm1.1Ast/J) 小鼠已被广泛用于 SLE 疾病模型。

研究团队在此基础上，检测其 H₂S 水平，发现细胞凋亡缺陷的 MRL/lpr 和 Bim−/− 小鼠中的 H₂S 水平显著降低。主要表现为：与野生型 (WT) 组相比，MRL/lpr 和 Bim−/− 小鼠的血液及肝脏、肺、脾和肾中的 H₂S 水平显著降低 (图 2 A-B)。与 WT 小鼠相比，来自 MRL/lpr  和 Bim−/− 小鼠的 PBMC 显示出细胞凋亡率降低和 H₂S 水平降低 (图 2C)。

图 2. 凋亡缺陷小鼠 H₂S 水平降低^[1]。

(A) 形成试验显示雌性 MRL/lpr 和 Bim^−/− 小鼠血液 H₂S 浓度降低; (B)形成实验显示，凋亡缺陷小鼠肝中 H₂S 浓度低于 WT 小鼠 (肺、脾、肾未显示); (C) 来自雌性 MRL/lpr 和 Bim^−/− 小鼠的 PBMC 显示凋亡细胞和 H₂S 水平降低。黄色箭头表示 H₂S，白色箭头表示凋亡细胞; (D) STS 处理提高了 MRL/lpr 小鼠的血液 H₂S 浓度，而 Z-VAD 处理降低了 H2 浓度; (E) STS 治疗增加了MRL/lpr 小鼠肝脏中的 H₂S 浓度 (肺、脾、肾未显示)，而 Z-VAD 治疗则抑制了该浓度; (F) STS 处理促进 MRL/lpr 小鼠 PBMC 中的细胞凋亡和 H₂S 生成，Z-VAD可减轻这种情况。黄色箭头表示 H₂S，白色箭头表示凋亡细胞。

同时，细胞凋亡诱导可以提高 MRL/lpr 小鼠中 H₂S 的水平，通过使用 Staurosporine (STS，用于诱导 MRL/lpr 小鼠体内细胞凋亡) 和 Z-VAD (OMe)-FMK（Z-VAD，一种泛半胱天冬酶抑制剂，用于抑制 STS 诱导的细胞凋亡）发现体内细胞凋亡诱导可以挽救 MRL/lpr 小鼠中降低的 H₂S 水平 (图 2D-F)。

更重要的是，凋亡细胞能够产生 H₂S。研究人员以小鼠骨髓干细胞 (mBMSCs)、PBMCs 和 CD4+ T 细胞为样本，STS 和 UV 诱导的细胞凋亡可以提高细胞上清液中 H₂S 水平 (图 3)。

图 3. 凋亡细胞体外释放 H₂S^[1]。

凋亡诱导 (STS 和 UV 处理) 后，使用形成测试评估不同细胞上清液中的 H₂S 浓度。结果表明，STS 和 UV 处理显著增加了 mBMSCs、PBMCs 和 CD4⁺ T 细胞中的 H₂S 浓度，而添加 Z-VAD 则降低了 H₂S 浓度。

此外，以 STS 诱导的 mBMSCs 凋亡为模型，发现凋亡的 mBMSCs 主要在凋亡的早期和中期产生 H₂S。

 

研究发现，凋亡细胞产生的 H₂S 有利于维持免疫稳态。一方面，细胞凋亡诱导可通过提高 MRL/lpr 小鼠中的 H₂S 水平来改善 SLE 表型。另一方面，凋亡细胞产生的 H₂S 抑制 MRL/lpr 小鼠中异常的 Th17 细胞分化。

流式细胞术分析表明，用 H₂S 供体 NaHS 处理直接抑制体外 Th17 细胞分化，而 Hydroxylamine hydrochloride (HA，H₂S 合成抑制剂) 处理则促进 Th17 细胞分化 (图 4A)。两种治疗均显示出剂量依赖性效应。且在体内 MRL/lpr 小鼠中，NaHS 处理降低了脾脏和血液中 Th17 细胞的水平，而 HA 处理增强了 Th17 细胞的分化。

图 4. 流式细胞仪分析 NaHS 和 HA 处理下的 Th17 细胞分化率^[1]。

 

▐  H₂S 通过 Sep15/STAT1/STAT3 轴抑制 Th17 细胞分化
通过探索 H₂S 调节 Th17 细胞分化的机制，发现 H₂S 通过 Sep15/STAT1/STAT3 轴抑制 Th17 细胞分化。

 Tips: H₂S 主要通过蛋白质硫化作用 (SHY) 发挥生物学功能和分子调节作用。SHY 是一种翻译后修饰，是一种生理过程，其中 H₂S 在半胱氨酸的硫醇 (-SH) 基团上添加额外的硫，产生氢过硫化物 (-SSH)。

在 STAT 家族中，磷酸化是核定位和随后的生物活性的必要先决条件。在 Th17 细胞分化过程中，H₂S 可以促进 STAT1 磷酸化并抑制 STAT3 磷酸化，免疫沉淀-质谱 (IP-MS) 和 coIP 测定证实 Sep15 可以与 STAT1 结合。且 H₂S 硫水合物 Sep15 在 C38 位点与 Sep15 结合并促进 Sep15 和 STAT1 之间的相互作用，从而促进 STAT1 的磷酸化和核定位。

图 5. H₂S 通过 Sep15/STAT1/STAT3 信号轴抑制 Th17 细胞分化^[1]。

(A) 当 STAT1 被 siRNA 敲低时，H₂S 未能抑制 Th17 细胞中的 p-STAT3 表达。(B) STAT1 的敲低削弱了 H₂S 对 Th17 细胞的抑制作用。(C) H₂S 抑制 Th17 细胞分化作用中 Sep15/STAT1/STAT3 轴示意图。 

此外，通过小干扰 RNA (siRNA) 敲低 STAT1 的表达，发现 H₂S 抑制 STAT3 的磷酸化，但该作用被 STAT1 的敲低所抑制 (图 5A)。当 STAT1 表达被敲低时，H₂S 对 Th17 细胞分化和相关基因表达的抑制作用也受损 (图 5B)，这表明 H₂S 的抑制作用与 Sep15/STAT1/ STAT3 轴密切相关 (图 5C)。

 

ApoV 是凋亡细胞的代谢产物，具有多种生物学功能。在哺乳动物中，H₂ 由 L-半胱氨酸通过三种酶合成，即胱硫醚 β-合酶 (cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶 (3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)。

研究发现凋亡的 mBMSC (apoMSC) 和 apoV 表达 CBS、CSE 和 3-MST（图 6A-B)。微电极测定显示 apoVs 可以产生 H₂S，而 HA 或 Propargylglycine (PAG, CSE 抑制剂) 处理抑制 apoVs 产生的 H₂S 浓度（图 6C)。也就是说，apoV 具有产生 H₂S 的能力。

图 6. H₂S 是 apoV 介导的 SLE 治疗所必需的^[1]。

(A) 通过蛋白质印迹评估 mBMSC、凋亡 mBMSC (apoMSC) 和 apoV 中 CBS、CSE 和 3-MST 的表达。(B) 通过免疫荧光法评估 apoV 中 CBS、CSE 和 3-MST 的表达。(C) H₂S 微电极显示 apoVs 产生 H₂S，HA 和 PAG 处理抑制 H₂S。(D-E) ApoV 抑制 IgG 在脾脏和皮肤中的沉积；箭头表示 IgG 沉积。(比例尺：肾脏为 20 μm，皮肤为 100 μm），而 CBS^−/− apoV 和 CSE^−/− apoV 的功能受损。

 

此外，凋亡细胞中的 H₂S 改善小鼠系统性红斑狼疮表型。通过收集 apoVs 并全身输注到 MRL/lpr 小鼠体内。结果表明，apoV 减轻了 MRL/lpr 小鼠的 SLE 表型，减轻了脾脏和淋巴结的重量，降低血清 ANA、BUN 和 dsDNA 水平，缓解肾脏损伤；并抑制肾脏和皮肤中的 IgG 沉积（图 6D-E)。然而，CBS−/− apoV 和 CSE−/− apoV （CBS−/− 和 CSE−/−小鼠，H₂S 缺陷小鼠，表现出 SLE 样表型) 均未能在 MRL/lpr 小鼠中发挥这种治疗作用（图 6D-E)。这些数据表明 apoV 可以产生 H₂S，这是 SLE 小鼠的治疗效果所必需的。

由此可见，细胞凋亡并非“坏事”，细胞凋亡后也并不是最终的结局，其释放的 H₂S 气体可以抑制 Th17 细胞分化，维持免疫稳态。同时，凋亡细胞中的 H₂S 可改善小鼠系统性红斑狼疮表型。

 

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Staurosporine 凋亡诱导剂, Staurosporine 也是一种有效，ATP 竞争性的，非选择性蛋白激酶抑制剂，抑制 PKC，PKA，c-Fgr，和 Phosphorylase kinase 的 IC50 分别为 6 nM，15 nM，2 nM，3 nM。Staurosporine 也抑制 TAOK2，IC50 值 3 μM。

Z-VAD(OMe)-FMK 一种不可逆的 pan-caspase 抑制剂。Z-VAD(OMe)-FMK 是泛素 C 末端水解酶 L1 (UCHL1) 抑制剂。Z-VAD(OMe)-FMK 通过靶向 UCHL1 活性位点对 UCHL1 进行不可逆地修饰。

Hydroxylamine hydrochloride 一种选择性单胺氧化酶 (MAO) 抑制剂，可用于抑制血小板聚集。Hydroxylamine hydrochloride 是有机合成的中间体。

Bafetinib 一种具有口服活性的 Lyn/Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制剂。Bafetinib 通过 Bcl-2 家族调节的内在凋亡途径增强几种促凋亡的 Bcl-2 同源性 (BH) 3-纯蛋白 (Bim、Bad、Bmf 和 Bik) 的活性，并诱导 Ph+ 白血病细胞凋亡。Bafetinib 具有抗肿瘤活性。

‍WEHI-9625‍ 一种首创的，三环砜小分子凋亡抑制剂，EC50 值为 69 nM。WEHI-9625 与 VDAC2 结合可促进其抑制小鼠 BAK 诱导的细胞凋亡的能力，但对人 BAK 和与凋亡效应密切相关的 BAX 因子均完全无效。

 

参看文献：
[1] Ou Q, et al. Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation. Cell Metab. 2024 Jan 2;36(1):78-89.e5.