高分 STM 文献解析：体内全基因组 CRISPR 激活筛选联合高通量测序寻找肺腺癌脑转移潜在治疗靶点

导师给了临床样本，你却不知如何下手？想按照常规操作找靶点，却毫无头绪？本期，咱们就来唠唠，基于临床样本，如何寻找新靶点？

道理很简单，先说思路：对比疾病人群的临床样本与正常对照，筛选出疾病发生发展过程中表达水平或功能发生显著改变的关键生物分子，如蛋白质、差异基因等。这些生物分子可以作为后续药物研究的潜在疾病靶点。

下面我们结合发表于Science Translational Medicine (IF=15)，题为 “A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis” 的文献，一起来感受下该方法在科研中的实际应用^[1]。

临床样本并不是拿过来就能直接用的！

拿癌症举例，通常是采集患者的原代瘤体样本，也就是从患者体内直接切除下来的新鲜组织，接着提取出肿瘤细胞，种植到免疫缺陷的小鼠体内，让肿瘤在小鼠体内繁衍生长。——即：患者来源异种移植瘤 (PDX) 。然后再从小鼠体内的肿瘤中提取细胞，在实验室的器皿中培养，最终形成了用来做科研实验的稳定细胞系。该细胞系能够高度还原患者原本的肿瘤特征，是科研研究和测试新药的宝贵材料^[2]。

该文献案例中，作者使用的源自原代 LUAD 患者细胞系 CRUK0748-XCL，就是来源于 TRACERx 研究中的患者来源异种移植瘤。

                                                                                                         图 1. 肺癌 TRACERx 研究中 PDX 模型构建和扩增的研究方案示意图^[3]。

CRISPR 全基因组筛选是一种高通量功能基因组学技术，利用 CRISPR/Cas 系统 (通常为 CRISPR-Cas9) 的基因编辑功能实现基因敲除、敲入、激活和干扰。将 CRISPR 系统应用于构建基因组文库——构建全基因组 CRISPR 敲除 (CRISPRko)、干扰 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa) 文库——进行高通量筛选，是疾病 (尤其是肿瘤) 靶基因研究的主要策略，广泛应用于包括细胞系、小鼠和斑马鱼在内的多种模型中。

CRISPR 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。其操作流程主要包括设计合成 sgRNA 文库、Cas9 细胞系的构建、表型选择、高通量测序、生物信息学分析、候选基因和脱靶效应的验证等 (图 3)^[4]。

图 2. CRISPR/Cas9 高通量筛选流程^[4]。

 

CRISPR/Cas9 技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计 3~10 条 sgRNA，利用芯片一次合成数万条覆盖整个基因组的 sgRNA 库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，在适当的筛选条件下测试筛选前后 sgRNA 的丰度变化，进而找出候选基因。

该文献案例中，作者使用的是 “人 Calabrese 全基因组 CRISPRa 文库”，筛选能够增强原位肺腺癌 (LUAD) 肿瘤脑转移的基因。

——肿瘤转移通常不是因为某个基因丢失了，而是因为某些原本不该表达的基因被异常激活、高表达，从而赋予了癌细胞侵袭和跨越屏障的能力。

Calabrese 文库通过 CRISPRa 技术，强行上调人体 18,000 多个编码基因的表达。赋予癌细胞“新的超能力”： 比如，某个肺癌细胞平时不具备穿透血脑屏障的能力，但文库恰好激活了它体内的某个基质金属蛋白酶基因，该细胞就突然获得了“通关”能力。

CRISPRa 系统的运作包含两部分：sgRNA (“导航地图”) 和 dCas9-转录激活因子 (“执行机器”) ； Calabrese 文库只有针对全基因组的 sgRNA 序列 (当然，也可以抗性筛选标记如 Puromycin，常用于寻找潜在的“耐药基因”) 。

dCas9-VP64 融合蛋白，需要细胞系预表达。该文献案例中，作者将 CRUK0748-XCL 细胞系改造为 CRUK0748-XCL-GLD 细胞，使其表达催化失活的 dCas9 与 VP64 融合的蛋白 (用于激活基因转录) 、GFP 和荧光素酶 (用于体内追踪) 。

简单来说：使用了一种“没有剪切活性”的突变 Cas9 蛋白 (称为 dCas9) 。在 dCas9 上连了一些“转录激活因子” (如 VP64、p65、HSF1) 。当它被向导 RNA (sgRNA) 带到基因的启动子区域时，它不剪断 DNA，而是像一个放大器一样，疯狂招募细胞自身的转录机器，从而强烈提高目标基因的表达量。

作者将 CRUK0748-XCL-GLD 细胞以 0.3 的 MOI 进行转染，并筛选至最终文库覆盖度为 500 倍。随后经开胸手术，将转染文库的细胞直接接种到 30 只 NSG 小鼠的肺部 (图 3)。

                                                                                                                                         图 3. 体内 CRISPR 激活筛选示意图^[1]。

通过生物发光成像追踪肿瘤负荷，终点对肺和脑组织进行 sgRNA 测序并比较其富集程度，结合 TCGA 与 DepMap 数据库筛选出 12 个候选基因，其中 BACE1 的 sgRNA 在大脑中富集超过 150 倍。

随后通过独立 sgRNA 验证、组织微阵列及临床样本分析发现，BACE1 表达增加会增强 LUAD 的骨髓转移 (图 4) 。此外，在 BACE1 过表达的肺肿瘤小鼠的肝脏和骨骼中，转移负荷均有所增加。

                                                                                                              图 4. 使用两种独立的 sgRNA 激活 BACE1 表达可增加脑转移肿瘤负荷^[1]。

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