细胞培养：来源、类型、培养条件、常见污染

细胞培养，又称细胞克隆技术。科研中使用的细胞主要来源于动植物组织、人类捐献的临床样本或商业细胞库。

科研实验常用到的细胞主要是原代细胞和细胞系。

• 来源：直接从动植物活体组织 (如手术切除的肿瘤组织、活检样本或实验动物器官) 中分离提取出来的细胞。——更接近体内状态。

• 特点：最接近生物体内的真实生理状态，实验结果可信度高。但体外寿命有限，通常只能传代几次就会衰老死亡。

图 1. 原代细胞分离和培养技术-以小鼠原代肝细胞为例[1]。

• 定义： 原代细胞经首次传代成功后，在体外具有无限增殖能力 (永生化) 或有限寿命的细胞群。——最常用，一般从国家或专业细胞资源库 (如 ATCC) 购买成熟的细胞系。

• 特点： 遗传背景明确，生长均一性好，易于基因编辑和大规模培养。

既包括有限传代细胞系 (传代次数有限)，也包括连续/永生化细胞系 (可长期传代)：

(1) 有限传代细胞 (Finite Cell Line) : 能在体外分裂有限次数 (如人成纤维细胞系约传 50 代后停止) 后衰老的细胞。——增殖受分裂次数限制。

(2) 无限细胞系 (Immortalized Cell Lines): 指通过基因突变/转化或病毒感染，在体外培养中获得无限增殖能力的细胞群体。——通常由原代细胞转化而来，分裂次数可超过 50 代甚至无限传代。

【举例】人宫颈癌 HeLa 细胞——最著名的细胞系之一，是医学上最早经由人工培养的永生不死的细胞，被广泛用于医学研究。

图 2. HeLa 细胞光学显微图像[2]。

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【原代细胞 VS 细胞系】

——怎么选更“适合”你的实验？

原代细胞和细胞系都来源于真实生物组织，是体外实验中最常用的两类模型，但二者在来源与建立方式、遗传/表型稳定性、可控性与重复性、以及实验定位上存在本质差异[3][4]。

表1. 原代细胞与细胞系的区别。

细胞株是从原代培养物或细胞系中，通过单细胞克隆或特殊筛选，获得具有特定遗传特征、生物学标志或功能的纯化细胞群。细胞株常用于特定的研究中，例如，某些细胞株被用于生产蛋白质、疫苗或其他生物制品。

很多人不太看重培养条件，认为自家细胞“能活”就行。但实际上，培养条件本身就会影响实验结果。

——大家购买细胞时要看下培养说明，使用合适的细胞培养基培养。如在 ATCC ( American Type Culture Collection) 购买的细胞系来源和培养条件都可在其官网查询得到。当然，往期也有为大家做过常用实验细胞的培养方案的汇总。

表 2. 举例：癌症细胞的培养条件[8]。

细胞培养的流程大致为：接收细胞——处理细胞——细胞培养——细胞传代——冻存与复苏。详细操作可查看往期推文：基础细胞培养方法及步骤；细胞冻存与复苏避坑指南。此外，还应注意一些关键的培养条件：

（1）培养基类型 (如 DMEM、RPMI 1640) ：不同细胞对葡萄糖、氨基酸、缓冲体系的需求不同。

表 3. 细胞培养：常见细胞培养基。

（2）血清及添加物：存在批次差异，是否热灭活、保存与反复冻融也会影响细胞表现。

——MCE 可提供胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) ，其来源于非疫区健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、 BTV 等牛源病毒)，由剖腹产 5-8 月龄胎牛的血液制备而成，产地乌拉圭。

表 4. 细胞培养：血清常见问题。

（3）生长方式： (1) 贴壁细胞：需注意消化方式对表面蛋白的影响； (2) 悬浮细胞：需关注密度。

（4）传代与密度：决定细胞是否进入应激、漂移或选择性生长状态，尤其是连续传代时更明显。

细胞培养？小心污染！目前，支原体污染仍是污染的根本原因，被称为最“安静”的实验杀手。

支原体污染往往不引起培养基浑浊，也不一定明显改变细胞形态，因此极易被忽视。但大量研究表明，它会显著影响细胞的代谢状态、增殖能力和基因表达谱，从而直接干扰药物反应和实验结论[4][9]。

由于支原体污染不易被肉眼观察到，因此需要借助一些检测方法来确认。目前已开发出多种检测细胞培养中支原体污染的方法，包括直接培养法、DNA 染色法、基于酶联免疫吸附试验 (ELISA) 的方法以及 PCR 检测法等。点击查看细胞支原体污染的检测。

其中，PCR 类方法因灵敏度高、覆盖面广，更适合用于日常筛查，已成为多数细胞库和实验室的常规选择[4]。

图 3. PCR 法检测支原体：阳性与阴性结示例[4]

(a) 常规 PCR 电泳结果示例：阴性样本仅出现内参条带，而阳性样本可检测到对应支原体的特异扩增条带。(b) 实时 PCR 检测曲线示例：阳性样本出现明显的扩增曲线，而阴性样本仅显示内参扩增信号。

支原体不是“偶发事故”，而是必须被假设“随时可能存在”的风险变量。最稳妥的策略始终是：定期检测 > 及时隔离 > 不指望“事后补救”。

小 M 为大家汇总了一些查询平台，有需要的小伙伴可以收藏起来，作为日常查询固定入口~

表 5.常用细胞查询网址。

国家实验细胞资源共享平台由中国科学院系统建设，整合了国内多家权威细胞库资源，提供细胞来源、培养条件及质量控制等信息，是国内科研人员查询和获取标准化细胞资源的重要平台。

ATCC 是国际上最具权威性的生物资源保藏机构之一，提供经过严格鉴定的细胞系及其详细培养条件说明，广泛作为国际科研和期刊投稿中推荐的细胞来源参考。

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参考文献

[1]Charni-Natan M, et al. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR Protoc. 2020 Aug 13;1(2):100086.

[2] SHAYLA KABIR, et al. STUDY OF CHEMOPREVENTIVE ROLE OF PADDY HUSK ON CERVICAL ADENOCARCINOMA.HUMAN CELL LINE (HELA CELLS).ASIAN JOURNAL OF PHARMACEUTCALAND CUNICAL RESEARCH.Vol 17, Issue 3, 2024.

[3] Geraghty RJ, et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 2014 Sep 9;111(6):1021-46. doi: 10.1038/bjc.2014.166. Epub 2014 Aug 12.

[4] Weiskirchen S, et al. A Beginner's Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells. 2023;12(5):682. Published 2023 Feb 21.

[5] Chan M, et al. Novel insights from a multiomics dissection of the Hayflick limit. Elife. 2022;11:e70283. Published 2022 Feb 4.

[6] Souren NY, et al. Cell line authentication: a necessity for reproducible biomedical research. EMBO J. 2022;41(14):e111307.

[7] Baust JM, Buehring GC, Campbell L, et al. Best practices in cell culture: an overview. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(8):669-672.

[8] Hauser S, et al. Application of a Fluorescence Anisotropy-Based Assay to Quantify Transglutaminase 2 Activity in Cell Lysates. Int J Mol Sci. 2022 Apr 19;23(9):4475.

[9] Corral-Vázquez C, et al. Cell lines authentication and mycoplasma detection as minimun quality control of cell lines in biobanking. Cell Tissue Bank. 2017;18(2):271-280.