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公司新闻/正文

实验操作 | 滴滴! 解锁 T 细胞活化 — 诱导实验秘籍

563 人阅读发布时间:2025-08-28 14:39

T 细胞在机体防御体系中扮演着不可或缺的角色,它不仅是清除病原体的"主力军",还是维持免疫记忆的"守护者",保护机体免受再次侵害!在体外实验中诱导 T 细胞对免疫反应,尤其是 CAR-T 疗法的深入研究意义重大......
Section.01
T 细胞激活的机制

T 细胞的活化需要两种信号的共同参与。

第一信号是 TCR-CD3 的复合物,其传导的强度和持续时间决定了 T 细胞的激活程度,其中 TCR 特异性地识别抗原肽-MHC 复合物,CD3 将识别的信号传递到细胞内部。研究表明,通过调节 CD3 的信号传导,可以增强或抑制 T 细胞的免疫反应。例如,CD3 抗体 (如 OKT3能够识别 TCR-CD3 复合体上 CD3 分子的 ε 链,模拟抗原-MHC 的作用,直接激活 T 细胞,调节 T 细胞的增殖[1][2]

T 细胞激活还需要第二信号,即共刺激信号。最常见的共刺激分子是 CD28,它可以和树突状细胞表面的 B7 分子结合,共同促进 T 细胞的激活过程,并且增强 T 细胞的增殖和分化。CD28 抗体可以通过不同的机制激活或抑制 T 细胞活性,为免疫调节提供了重要工具[3]

画板 98.png

图 1. T 细胞激活的主要信号[4]

信号 1:TCR 与 CD3 结合,传递 pMHC 信号;信号 2:共刺激信号 CD28 与 B7 分子(CD80/86)结合,促进 T 细胞的增殖和激活;信号 3:细胞因子,如 IL-2 和 IL-12,调节 T 细胞的增殖和分化。

当 T 细胞被激活后,它们会退出静止状态,进入快速的克隆扩增阶段。被激活的 T 细胞会多次分裂,产生大量具有相同 TCR 的子代细胞。这些子代细胞将进一步分化为效应 T 细胞和记忆 T 细胞。效应 T 细胞如 CD4+ T 细胞分化为 Th1、Th2、Th17 等亚群,承担独特的免疫调节功能;CD8+ T 细胞则分化为细胞毒性 T 细胞,直接杀死靶细胞。另一部分子代细胞会分化为记忆 T 细胞,在后续的病原体再感染中提供快速且有效的免疫反应[2]

Section.02
诱导 T 细胞活化的方法

T 细胞激活也可以通过化学途径或抗体途径实现。使用 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞可以模拟体内自然的免疫反应,适合研究抗原特异性 T 细胞反应。通过 PMA/Ionomycin 化学途径能够快速诱导 T 细胞激活,但是可能对细胞产生非特异性毒性。

抗 CD3ε 抗体能够特异性结合 CD3ε 链,模拟抗原呈递细胞 (APC) 与 TCR 的相互作用,激活 T 细胞。抗 CD28 抗体可以分为超激动型、常规抗型、调节型以及单价抗 CD28 抗体。
PMA 可以模拟细胞内信号分子 DAG,直接激活蛋白激酶 PKC,绕过 TCR 激活的早期步骤,直接触发下游信号通路。Lonomycin 是一种钙离子载体,能够选择性地结合钙离子并增加细胞质内的钙离子浓度,模拟 IP3 的作用,激活钙调蛋白 CaM 和钙调磷酸酶 CaN,激活 NFAT 并促进细胞因子的表达。PMA 和 Ionomycin 的联合作用可以促进 T 细胞活化[5]
新闻图片1

图 2. PMA/Ionomycin 诱导 T 细胞活化的通路。

PMA 激活 PKC 和 Ras 信号通路,Ionomycin 诱导细胞质内钙离子含量升高,两者通过协同作用激活 AKT 信号通路,非 TCR 依赖性地诱导 T 细胞激活。

表 1. PMA/Ionomycin 和 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞的作用机制和激活效果的比较[5]

新闻图片2

CD3/CD28 抗体诱导 T 细胞活化[5]:

1. 细胞提取

(1) 使用 C57BL/6 小鼠的脾脏作为细胞来源,将其研磨为单细胞悬液,用滤网过滤去除组织碎片。
(2) 使用红细胞裂解液裂解红细胞,获得富集的白细胞并重悬。

2. 细胞分选

(1) 选择合适的小鼠 CD3/CD8 细胞分选试剂盒,按照试剂盒说明书标记小鼠的 CD3+ 和 CD8+ T 细胞,并通过磁性分离珠分离目标细胞。
(2) 可用流式细胞术鉴定分选后的细胞,确保细胞纯度在 95% 以上。

3. 细胞培养

分选后的 T 细胞在 37 ℃、5% CO2 的条件下,培养在含有 2 mM Glutamine,10% FBS 和 penicillin-streptomycin 的完全培养基 RPMI 1640 中。

4. 抗 CD3ε 抗体和抗 CD28 抗体刺激活化

PMA/Ionomycin 诱导 T 细胞活化[5]:

细胞提取、分选和培养的具体步骤如上文 CD3/CD28 抗体诱导 T 细胞活化 1-3 所示。

4. PMA/Ionomycin 刺激活化

T 细胞活化的鉴定[1][7][8]

T 细胞活化在早期 (通常为激活的第一个 24 小时) 的表现为 CD25、CD38、CD69、CD154、HLA-DR 和 ICOS 表达的上调,和 CD127 表达的下调。
长时间的持续刺激导致 T 细胞进入功能耗竭状态 (通常为激活的 96 小时),PD-1、CTLA-4 和 TIM-3 表达提高,细胞因子如 IL-2、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌减少。这些蛋白是 T 细胞耗竭的标志物,是细胞程序性死亡蛋白或具有抑制 T 细胞活化和增殖的作用。
新闻图片3

图 3. T 细胞活化导致细胞表面标志蛋白的变化[9]

髓系白血病细胞通过共刺激分子诱导 T 细胞激活,但长时间的刺激最终导致 T 细胞功能耗竭。这种耗竭状态通过抑制性受体的上调和细胞因子分泌的减少来体现。T 细胞激活导致 CD25、CD69、ICOS 和 CTLA-4 表达升高,CD127 表达降低;T 细胞耗竭时 CD127 和 CD69 表达减少,PD-1、TIM-3 和 LAG3 表达提高。

 

表 2. T 细胞激活后的 24 小时内,细胞表面标志物和分泌的细胞因子的表达量变化[7][8][9]

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[1] Chi H, et al., Principles and therapeutic applications of adaptive immunity. Cell. 2024 Apr 25;187(9):2052-2078.
[2] Menon AP, et al., Modulating T Cell Responses by Targeting CD3. Cancers (Basel). 2023 Feb 13;15(4):1189.
[3] Poirier N, et al., CD28-specific immunomodulating antibodies: what can be learned from experimental models? Am J Transplant. 2012 Jul;12(7):1682-90.
[4] Wong W K, et al. Engineering advanced dynamic biomaterials to optimize adoptive T-cell immunotherapy[J]. Engineered Regeneration, 2021, 2: 70-81.
[5] Gao R, et al., Protein phosphatase 2A catalytic subunit β suppresses PMA/ionomycin-induced T-cell activation by negatively regulating PI3K/Akt signaling. FEBS J. 2022 Aug;289(15):4518-4535.
[6] Trickett A, et al., T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003 Apr 1;275(1-2):251-5.
[7] De Biasi S, et al., Marked T cell activation, senescence, exhaustion and skewing towards TH17 in patients with COVID-19 pneumonia. Nat Commun. 2020 Jul 6;11(1):3434.
[8] Rha MS, et al., Activation or exhaustion of CD8+ T cells in patients with COVID-19. Cell Mol Immunol. 2021 Oct;18(10):2325-2333.
[9] Ozkazanc D, et al., Functional exhaustion of CD4+ T cells induced by co-stimulatory signals from myeloid leukaemia cells. Immunology. 2016 Dec;149(4):460-471.
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