蛋白质表达与纯化手册 | MCE

蛋白质，作为生命活动的主要执行者，构成了生命的物质基础。中心法则的提出让分子—蛋白研究得以具象化，DNA 的复制、转录和翻译，使神奇而复杂的生命现象得以解析。

从序列的合成至其转化鉴定，再到蛋白质的表达以及最终的纯化，每一个环节都需要精确且细致的设计而这一全过程的探索，无疑为我们打开了生命研究的新视野。在此过程中，MCE 提供全品类的产品和全方位的服务助力您的科学研究。

载体构建是生物技术中的一项关键步骤，主要用于克隆、表达特定基因以及进行基因编辑等研究。MCE 提供分子克隆工具、琼脂糖凝胶电泳等产品，使您的载体构建和分析检测过程更加快捷高效。

蛋白样本制备是蛋白生物学实验的核心步骤。其主要目的是：从组织或细胞中提取蛋白质，用于蛋白质纯化和浓缩，进而检测和分析。MCE 提供的抑制剂 Cocktail 和裂解液能在最-大程度上确保蛋白的有效提取，为您的实验研究提供有力保障。

蛋白纯化的目的是从复杂的样本(如细胞裂解液或组织提取物)中筛选、提取出特定的蛋白质。在分子克隆载体构建设计时，通过添加易于检测的标签实现后续蛋白质的纯化。MCE 提供磁珠、琼脂糖磁珠、琼脂糖等纯化介质，能够有效地纯化带有 HA、c-Myc、His、GST、Flag 等标签的蛋白质，同时 MCE 也提供抗体纯化相关产品。

蛋白质分析检测在生物化学和分子生物学实验中扮演着重要的角色。MCE 可提供一套全面的产品工具，以助力您高效进行蛋白质的纯度、大小和浓度等检测。

客户验证：

稳定可靠，重复性高

特异性强，背景干净

1. HY-K1004 与 HY-K1007 两款核酸染料的区别是什么？

2. PCR 扩增效率低，条带较弱或无扩增，该如何解决？

(1) 酶：实验表明，PCR 酶对于 DNA 具有一定的偏好性。如使用一种酶经过优化难以获得理想扩增时，可以尝试其它 PCR 酶。

(2) 模板引物：确保模板、引物的品质，保证没有降解。另外，如果模板含有较多的抑制物时(如植物基因组模板)，推荐使用抗抑制能力强的 PCR 酶；还可以对模板进行梯度稀释后扩增，摸索合适的模板用量。

(3) 反应体系与条件：增加循环数、降低退火温湿度、适当提高 Mg2+工作浓度，都可以提高扩增效率，但同时会导致特异性与保真性下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。

3. 现有几款裂解液之间有什么区别？该如何选择？

4. 抑制剂该如何选择？

注：HY-K0021 和 HY-K0023 均为 HY-K0022 的有效补充，使用时建议选择组合形式：HY-K0021 + HY-K0022 或 HY-K0022 + HY-K0023 ，可以单独使用，但不推荐。

5. His 标签蛋白纯化后蛋白纯度不佳，是什么原因导致的？有哪些方法可以改善？

(1) 洗脱条件：使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同，需要摸索优化；

(2) 介质因素：杂蛋白与介质可能存在非特异性结合，可以在在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 ( 推荐浓度 : ≤ 20 mM，因蛋白而异 )，降低非特异性结合；

(3) 蛋白间作用：杂蛋白与目的蛋白可能存在非特异性结合，可以在在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂( Triton X-100: ≤ 1% )、甘油 ( ≤ 10% )、NaCl ( ≥ 300 mM )、还原剂 ( β- 巯基乙醇 : ≤ 20 mM ) 等组分；

(4) 目的蛋白降解：建议在低温下纯化目的蛋白，并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂( 如 HY-K0010、HY-K0011 等 )；

(5) 存在表达提前终止：表达终止导致蛋白未正确携带标签，建议更换表达载体。

6. 磁珠与琼脂糖凝胶产品应该如何选择？

(1) 免疫沉淀( 当样品体积 < 2 mL )。在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时，磁珠可实现结合能力/得率、可重复性

纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准 IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 pull-down 反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择。

(2) 蛋白质纯化(当样品体积 > 2 mL)。当需要获得大量目标蛋白时，可选用琼脂糖凝胶，琼脂糖适用于柱亲和色谱或独立大型旋转杯免疫沉淀反应。

7. 为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同？

蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲，蛋白质越小，在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响，因此，观察到的实际条带大小可能与预测的不同。

常见的因素：

(1) 翻译后修饰：磷酸化、糖基化等，蛋白实际会偏大

(2) 翻译后切割：许多蛋白先被合成为前蛋白，然后被切割产生活性形式，例如前半胱天冬酶，蛋白实际会偏小；

(3) 剪接变体和异形体：可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质；

(4) 聚体：蛋白质形成多聚体。这种情况通常在还原条件下可以缓解，但强相互作用会导致较大的条带出现。

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