ROC-325抑制剂诱导肾细胞癌凋亡

　　ROC-325 是一种有效的具有口服活性的自噬 （autophagy） 抑制剂，具有很强的抗癌活性。ROC-325 引起溶酶体脱酸，自噬体积累和自噬通量中断。ROC-325 还诱导肾细胞癌凋亡 （apoptosis）。

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　　生物活性

　　体外研究

　　ROC-325以atg5 /7依赖的方式拮抗肾细胞癌（RCC）的生长和存活，诱导细胞凋亡，并表现出良好的选择性。ROC-325对A498、A549、CFPAC-1、COLO-205、dlc -1、ig罗夫-1、MCF-7、MiaPaCa-2、NCI-H69、PC-3、RL和UACC-62细胞的IC50分别为4.9 μM、11 μM、4.6 μM、5.4 μM、7.4 μM、11 μM、11 μM、5.8 μM、5.0 μM、11 μM、8.4 μM和6.0 μM。ROC-325诱导自噬抑制的标志性特征并拮抗自噬通量。

　　ROC-325引发组织蛋白酶D （CTSD）水平的显著升高。5 μM ROC-325处理24小时可导致A498和786-0 RCC细胞中LC3B点的形成和LC3B水平的显著增加。在A498和786-0细胞中进行的免疫印迹分析表明，ROC-325促进LC3B表达的剂量依赖性增加，其方式与p62和组织蛋白酶D水平的相应增加相关。

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

　　体内研究

　　口服ROC-325 （25 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg）给786-0 RCC异种移植物小鼠耐受性良好，在抑制肿瘤进展方面明显比羟氯喹更有效，并能抑制体内自噬。

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　　实验参考方法

　　激酶试验

　　用ROC-325孵育肾癌细胞24小时。细胞被收获，然后被溶解。从每个样品中提取约50 μg的细胞总蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用5%脱脂乳在含有0.1% Tween-20的tris缓冲盐水溶液中阻断膜1小时。然后用一抗在4°C下探针过夜，洗涤，并用偶联的种特异性二抗探针辣根过氧化物酶。免疫反应性物质通过增强化学发光检测。

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　　细胞试验

　　通过MTT法估计细胞活力。细胞被播种到96孔的微培养皿中，每孔10000个细胞，并允许附着24小时。然后用ROC-325处理细胞72小时。ROC-325处理后，加入MTT，用酶标仪定量甲醛吸光度。通过将各自的甲醛光密度归一化到对照细胞的密度，计算每个实验条件下估计的细胞活力。通过碘化丙啶（PI）染色和荧光活化细胞分选（FACS）分析亚g0 /G1 DNA含量，以及使用商业试剂盒流式细胞术测量活性caspase-3，定量分析ROC-325体外暴露后的促凋亡作用。同靶点产品推荐：Bafetinib是Bcr-Abl抑制剂

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　　动物实验

　　786-0肾癌细胞（5×106）悬浮在HBSS和Matrigel的混合物中，皮下植入雌性裸鼠。每种细胞系异种移植的荷瘤动物被随机分为治疗组。小鼠用载药（水）、ROC-325（25、40和50 mg/kg PO） QD×5治疗6周。每天监测小鼠，每周测量两次肿瘤体积。在研究结束时，从每组有代表性的动物中切除肿瘤，用福尔马林固定，石蜡包埋进行免疫组织化学分析。

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