DAPT抑制Notch

　　DAPT（GSI-IX）是一种有效的，口服活性的γ分泌酶（γ-secretase）抑制剂，对总淀粉样β（Aβ）和Aβ42的IC50分别为115 nM和200nM。DAPT抑制Notch 1信号并并诱导细胞分化。DAPT可以诱导细胞自噬（自噬）和（凋亡）。DAPT具有神经保护活性，可以用于自身免疫性和淋巴。增生性疾病，退化性疾病和癌症的研究。

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　　生物活性

　　DAPT体外活性

　　DAPT抑制Aβ的产生超过90％，仅影响培养基中APPβ的适度降低。尽管通过DAPT处理可将APPβ降低约30％，但这种作用不是浓度依赖性的，并且通过去除DAPT可以逆转。用递增浓度的DAPT（0、25、50和75μM）处理CNE-2细胞，并且在48小时后以剂量依赖的方式降低γ分泌酶生成的Notch 1片段Val1744-NICD（P <0.01 ）。在浓度为50μM的DAPT中，γ-分泌酶的激活几乎完全被抑制

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

　　体内活性

　　将DAPT给予PDAPP小鼠（100 mg / kg sc），并在大脑皮层中检查DAPT和Aβ的水平。在治疗后3小时，大脑中的DAPT峰值达到490 ng / g，并且在最初的18小时内，持续维持高于100 ng / g（？200 nM）的水平。这些DAPT的大脑浓度超过其IC50 降低神经元培养物中的Aβ（115 nM），并产生强大的药效并维持药效。DAPT通过下调大鼠Notch 1和核因子kappa B的表达来保护大脑免受脑缺血的侵害。Western印迹分析还显示DAPT（0.03 mg / kg）组中Notch 1和NF-κB表达显着降低（P <0.05 vs. MCAO组）

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　　实验参考方法

　　细胞测定

　　用APP基因转染的人胚胎肾细胞751（HEK 293）用于常规Aβ还原测定。将细胞铺在96孔板中，并在补充有10％热灭活胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中粘附过夜。将细胞在37°C下用DAPT（0、0.4、2、10、50和250 nM）预处理2 h，吸出培养基，并加入新鲜的化合物溶液。再经过2小时的处理后，取出条件培养基，并通过对总Aβ特异的夹心ELISA（266-3D6）进行分析。相对于用0.1％DMSO处理的对照细胞测量Aβ产生的减少，并表示为抑制百分数。使用XLfit软件将来自至少六次剂量的数据一式两份地拟合到四参数逻辑模型中，以确定效力

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　　动物实验

　　老鼠

　　过表达APP的三至四个月大的杂合PDAPP转基因小鼠V717F淀粉样前体蛋白的突变形式。每个治疗组（n = 10）由相等数量的年龄匹配的雄性和雌性动物组成，它们在治疗前禁食过夜。治疗组和对照组均以10 mL / kg的剂量分别使用DAPT或溶媒给药。处理组织并进行所有Aβ和APP测量。除去大脑后，将来自一个半球的皮质匀浆，离心，然后将上清液用于Aβ测量。将另一半球的皮层速冻以分析化合物水平。Aβ水平以湿组织重量的ng / g表示，相对于媒介物处理过的对照动物的平均Aβ水平计算减少的百分比。使用Mann-Whitney非参数统计分析数据以评估重要性。

　　老鼠

　　使用雄性Sprague-Dawley大鼠（260-290g）。MCAO后立即将DAPT溶液立体定向注入脑侧脑室（LV）。立体定向注射到左前臂的坐标为-0.8 mm，后外侧为±1.5 mm，后腹坐标为-4.5 mm。将30只大鼠随机分为三个手术组（每组10只大鼠）：假手术组，其接受等体积的PBS而无MCAO手术；MCAO组在MCAO后接受等体积的PBS（MCAO）；MCAO后接受DAPT 0.03 mg / kg的DAPT组。手术后24小时评估第一神经功能，然后手术后48小时评估第二神经功能。同时，测量并比较不同组之间的脑含水量和梗塞体积。

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